使用Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统进行in cell western 检测

简介

蛋白质印迹在1979年首先被提出。自那以后，随着技术，试剂和成像技术的改进大大拓宽了蛋白质印迹的使用，使其成为当今生命科学的基础实验之一。

然而，Western印迹的一般工作流程变化不大。 首先进行蛋白的抽提，然后通过电泳分离蛋白质，转印并用一抗和二抗进行杂交，最后显色。 通过这些步骤，蛋白质印迹需要对设备，培训，试剂投入大量的花费和时间的花费。

标准的Western印迹流程需要两天的时间才能从样本获得图像。 因此，在分析大量样品或进行优化时，很容易看出Western Blotting会有一定的瓶颈。

In-cell western - 对标准方法的重新思考，将蛋白质印迹中的蛋白质的准确定量与ELISA的重复性，快速性和高通量相融合。 细胞长在无菌的培养孔中，在原位固定和透化。 随后用特定的一抗进行孵育，然后用特异性荧光标记的二抗进行孵育。 使用近红外（NIR）光谱中的染料通常用于减少组织培养塑料板相关的自发荧光和噪音。

图1：典型的in-cell western成像

Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统专门设计用于在两个NIR通道（658 nm和785 nm）以及可见荧光波长（488 nm和520 nm）内进行成像，从而实现在孔内的多重成像。 这种多重检测允许在单个孔中评估多个感兴趣的蛋白质。

通过使用光电倍增管（PMT）和雪崩光电二极管（APD）检测器进行检测，Sapphire可实现信号选择性，灵敏度和成像速度使其成为细胞内蛋白质印迹的理想选择。

材料和方法

细胞培养

将HeLa细胞进行系列稀释并以每孔0.2mL的体积接种到无菌96孔组织培养板中，并生长至约80％。所有孔都使用100％甲醇室温渗透15分钟。

In-cell western

固定和透化之后，将细胞在PBS中冲洗，在室温下用含1％鱼胶的PBS封闭1小时，然后在4℃下孵育α-tublin和beta-actin 过夜。在用AzureSpectra 550和AzureSpectra 800的二抗孵育60分钟，将样品用PBS洗涤三次。

将二抗与RedDot TM 1核染色一起孵育用来归一化总细胞数目。 成像前如前所述洗涤样品板。

成像

洗涤后，使用Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统进行成像。

结果和讨论

在本说明中，我们展示了使用Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱系统定量细胞内蛋白的能力。 HeLa细胞使用α-tublin和beta-actin抗体，接着分别用AzureSpectra 550和AzureSpectra 800二抗进行孵育。 将所有孔用RedDot TM 1核染色剂染色归一化总细胞数目标。 使用Azure Biosystems Sapphire™双模式多光谱激光成像系统获取图像，如图2中所示。所显示的图像显示了可实现较高的灵敏度和特异性。

将连续稀释的HeLa细胞接种到96孔板中，培养，固定并透化。 A）使用AzureSpectra 550（绿色）探测第1-3列的beta-Actin 。 B）使用AzureSpectra 800（蓝色）探测第3-6列的Tubulin 。 C）整个板用RedDot1核染色作为标准化对照（红色）染色。 D）同时扫描各个通道，然后使用Sapphire Capture软件将其图像进行整合。

在96孔板上进行细胞Western blotting可以准确测量细胞内蛋白的原位表达; 并提供高通量的方法来评估多重检测，终点检测，感兴趣的蛋白质和重复性。 通过使用NIR抗体和Azure Sapphire™双模式多光谱激光成像系统，在多重分析的潜力和通量上都大大提高。