基于Naica数字PCR平台的鲤鱼疱疹病毒检测来啦！

什么是鲤鱼疱疹病毒?

鲤鱼疱疹病毒3（CyHV-3）是一种295kb的双链DNA病毒，是锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的病原体。目前该病毒已经蔓延到全世界许多国家，并被公认为鲤鱼和锦鲤养殖业的一个重要问题。它在锦鲤和鲤鱼养殖中造成大量死亡，经常造成80%以上的损失。

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近日，研究人员发现将该病毒在细胞培养物中连续传代后，病毒能够通过突变体外进化，并可能导致毒力的丧失或增加。这一研究结果发表在知名期刊《Viruses》上（IF= 3.279）。

为了验证这一假设，研究人员将CyHV-3 (KHV-T)分离株在鲤鱼脑(CCB)细胞中进行99次传代，通过感染鲤鱼的方式进行传代过程中病毒毒力的测定。结果显示，经过78次CCB传代后，病毒分离株的毒力明显低于原株，进一步研究发现在其ORF150处有一个1363bp的缺失。

整合基因组观察(IGV)截屏显示了包含7个序列样本大缺失的区域。每个水平轨迹对应于映射到KHVJ

参考基因组(AP008984)上的序列。白色区域表示没有读取，虚线表示删除边界。(P78 4次重复，P99 2次重复）

但这一现象在0次和第99次传代中并未检测到。针对这一现象作者用传统PCR进行了验证。

A图 :PCR引物位置,1代表覆盖整个ORF150引物，2代表缺失序列内设计的引物.

B图 :检测结果，1引物扩增片段长度为2593bp，2引物扩增长度为500bp；P0/P78/P99代表传代次数.

但是由于常规illumina测序和PCR扩增可能会受到多种因素的影响，导致检测结果有显著误差，特别是对于拷贝数非常低的序列的检测。因此研究人员又通过新一代数字PCR对该结果进行了验证。

用数字PCR技术定量分析缺失和正常的单倍型。(A)分析设计的示意图；(B)预期的扩增产物大小；

（C-F）数字PCR检测结果，红色通道反映undeleted和deleted单倍型浓度，蓝色通道代表undeleted单倍型浓度。

研究结果表明P78确实存在一个1363bp的缺失，并且这种缺失很可能与P78的毒力下降或衰减有关，也许会成为治疗鲤鱼疱疹病毒的潜在靶点，具体的机制仍有待进一步探。

该研究中应用的数字PCR检测平台为法国Stilla公司的Naica 数字PCR系统。该系统使用cutting-edge微流体创新型芯片——Sapphire芯片作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中，PCR扩增实验在芯片上实现。

该平台拥有强大的图像分析技术和直观可视的检测功能，从而达到了数字PCR定量卓越的置信水平，获得的数据真实可信。并且该系统目前为市面上最简单的数字PCR系统，也是首款可以实现3荧光通道检测的数字PCR平台。

目前，该产品已经广泛应用于肿瘤学研究、NIPT研究、液态活检、细胞治疗质控、用药及移植监控、致病微生物检测、食品安全、环境检测、核酸类标准物质定量等方面。

而且该研究中还用到由法国Stilla Technologies公司开发的Gene-π数字PCR技术交流平台解读实验数据。Gene-π作为数字PCR学习交流平台，为您全方位解读数字PCR技术，更多数字PCR技术可登陆Gene-π数字PCR学堂http://www.cycloudbio.com/p/72.html查看。