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深蓝云qPCR知识小课堂---TaqMan探针法

在之前发表的文章《实时荧光定量PCR检测方法,你选对了吗?》中提到,实时荧光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探针法、分子信标、荧光共振能量传递(FRET)和LUX Primers等。那么应用最为广泛的则是SYBR Green染料法和TaqMan探针法,两者各有所长。今天,先给大家介绍TaqMan探针法,它优秀在哪里?

TaqMan 探针法

最关键的Taqman探针,是一条与靶序列特异性结合的寡核苷酸序列,其能够结合到正反向引物结合区域的中间部位,随着PCR反应的进行,DNA聚合酶在延伸到探针位置时会将其水解,从而释放荧光基团,扩增产物产生信号。


TaqMan探针法的优势

☑  高特异性,只有在探针和靶标基因之间发生特异性的水解,才会生成荧光信号。

☑  多重分析,可选择不同的报告基因染料标记探针,在一个反应管内扩增并检测多个不同的序列。

☑  无需PCR后处理,减少分析工作量并节省材料成本。

探针序列的设计原则

1. TaqMan探针的长度最好不超过30bp。理想情况下,有15bp可获得最佳特异性;

2. Tm值在67℃-72℃之间,确保探针的Tm值比引物的高5-10℃,在退火过程中优先结合到模板上;

3. 探针序列的GC含量在20%至80%之间,避免多个重复的碱基出现,尤其要避免4个或超过4个的G碱基;

4. 探针尽量避免出现二聚体或者发夹结构,以保证足够高的模板结合效率;

5. 探针5’端不能为G,因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时,G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号,从而导致假阴性的出现。

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如何选择荧光基团和淬灭基团

修饰基团的选择是探针法的重要环节,那么我们需要注意以下几项:

1. 根据荧光定量PCR仪荧光通道,选择适配的荧光基团,优先选择常用的荧光基团,如FAM、VIC或CY5等;

2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA,自身会发出荧光信号,干扰检测结果,后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等;

3. 进行多重qPCR检测时,每个通道要选择不同的荧光基团,且避免各标记基团的激发和发射波长重叠,出现荧光干扰的情况。

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