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定量方法知多少--绝对定量

在做qPCR实验时,我们经常会问:“你是做绝对定量还是相对定量呢?”,而定量方法的选择是取决于实验的目标。绝对定量可测定目标核酸分子的实际拷贝数,但也是最费力、最复杂的定量形式。此方法要求周密的实验方案和高度准确的标准曲线,常用于确定病毒滴度。

使用标准曲线进行绝对定量

绝对定量是通过样品的Cq值和标准曲线进行比较实现的。首先为了建立标准曲线,需要已知拷贝数浓度的标准品,对标准品进行5次以上的连续梯度稀释,将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增,最后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线,得到线性方程Cq= -klgX0+b,其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较,确定其拷贝数浓度。

从图1可以发现,当模板起始浓度越大时,荧光达到阈值的循环数越少,即Cq值越小。反之,模板起始浓度越小时,Cq值越大。起始模板量的Log值与循环数Cq值呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线,即可确定未知待测样本中目的基因的量。

如何选择标准品?

如前所述,生成绝对标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。所以最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板,可优选有证的标准物质或参考物质。那么制备标准品的常见方法如下:

☑  DNA 标准品:目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆(图2)。

优点:易于生成、定量,可在适当的储存条件下维持稳定性。

缺点:无法进行qRT-PCR 的逆转录步骤,大大影响了反应效率。

PCR扩增片段:通过常规PCR进行目的片段扩增,回收纯化PCR扩增片段,可直接作为标准品,相对于质粒,PCR扩增片段不是那么稳定。

质粒克隆:将目的片段进行PCR扩增,回收目的条带后连入T载体,再进行质粒提取,OD值定量,将质粒梯度稀释作为标准品使用。

☑  RNA 标准品:目的靶点的体外转录RNA(图3)

优点:结合了RT效率,最大程度地模拟了目的靶点。

缺点:需要耗费时间生成该标准品,因其不稳定,难以保持长期准确度。

体外转录RNA:利用实时荧光定量PCR生成的PCR 产物可利用包含5’ T7启动子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆转录引物重新扩增。体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。纯化后可将其准确定量并稀释,用于生成标准曲线。

Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统——绝对定量示例

1、实验方法:

•方法:从组织中提取基因组DNA,以TaqMan探针法进行荧光定量检测

•试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

•标准品:质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 、102、101;3个重复;设阴性空白对照

•实验步骤:提取gDNA→设计特异引物探针→qPCR扩增→结果分析

2、实验数据:

3、标准曲线:

R^2=1    y= -3.349x+32.87

关于Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统

来自美国Azure Biosystems公司,以创新服务于生命科学为愿景。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统,为您的科学研究提供高精准、高灵敏的可靠结果。Azure Cielo-3/6检测通道,可根据实验需求灵活配置。同时配有10.3触控系统,主机本身可独立运行、连接、远程交互,让您随时随地知悉实验进程和及时获得实验结果。