qPCR实验的重要影响因素--抑制剂

在决定实时荧光定量PCR检测灵敏度、准确性和可靠性的众多因素中，模板质量是决定重复性和生物学相关性的重要因素之一。诸多报告中也描述了生物样品中常见的抑制成分会导致qPCR分析灵敏度和动力学的显著降低。

如何检测抑制剂：

多种方法可用于评估生物样品中是否存在抑制剂。常用方法是通过连续稀释样品来评估样品的PCR效率，PCR效率的高低一定程度上反映出样品质量的好坏。一个高效的PCR反应要求扩增效率在90%-110%之间，当扩增效率＞110%或＜90%，无论是相对定量还是绝对定量其最终结果都会不准确。那么怎么来判断是由于抑制剂引起的扩增效率异常呢？如图1所示，通过标准曲线的状态判断，当原液的数据点位于标曲上方（红色箭头），则极有可能是样本抑制剂抑制PCR反应导致Cq值偏大。

内部扩增控制（IACs）是一种与目标核酸共纯化和共扩增的方法，可用来检测抑制剂和指示加工过程中的模板丢失。IACs可包装在噬菌体外壳中，也可以是包含引物结合序列和探针检测序列的单链寡核苷酸。在荧光信号采集过程中，探针结合位点的部分不匹配阻止了与IACs杂交，随后可对熔解曲线进行分析，用以区分IACs和目标扩增子。IACs将是检测病原体的优质方案，但这种方法不适用于细胞mRNA定量，因为考虑为每个单一mRNA设计模拟物是不现实的。

另外，也可以通过使用外源性对照来测试抑制剂，也称为Spikes。该方法无论是在其构造技术的复杂性方面，还是在分析之后与它们的准确检测相关的额外工作方面，相对都是比较简单的。Spikes可以是RNA也可以是DNA分子，这取决于靶标类型。mRNA表达分析首选RNA Spikes，DNA靶标分析首选DNA Spikes。Spikes通常是几千个碱基/碱基对异型序列，所以不会与任何已知目标交叉反应。

抑制剂类型：

抑制剂可以是核酸提取过程中使用的试剂，也可以是从生物样品中提取的成分。抑制剂的影响，较好的情况是抑制剂会产生不准确的定量结果；最坏的情况是高度抑制会产生假阴性结果。常见的抑制剂类型如下：

1）样品本身的成分：许多生物样品本身就含有严重抑制逆转录和PCR反应的成分，如血液中的血红蛋白、免疫球蛋白G，肌肉中的肌红蛋白、胆盐、腐殖酸、尿素和胶原蛋白，植物中的多糖多酚等。

2）提取和纯化试剂的成分：许多用于纯化核酸的试剂，如苯酚、氯仿、硫氰酸胍、盐酸胍、乙二胺四乙酸、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠、噻唑、三唑和核糖核酸等。

如何降低抑制剂的影响：

当样本中存在抑制剂，高浓度模板中抑制剂浓度较高，对PCR反应的影响较大。低浓度模板由于稀释使得抑制剂浓度有所下降，抑制剂的抑制作用也相应降低。如果是样品本身的成分，可对模板进行稀释，或者进一步纯化，又或者改进提取方法来降低抑制剂的干扰。如果提取和纯化试剂的成分，其本身就是最有效的逆转录和聚合酶链反应的抑制剂，因此需要在提取和纯化过程中注意对试剂成分的去除，防治污染模板。

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