新手须知（上）--qPCR操作技巧分享~

实时荧光定量 PCR（qPCR）自问世以来，就受到了广大生命科学实验工作者和医院检验工作者的极大关注，使得该技术得到了很快的普及。虽然qPCR技术目前应用方向十分广泛，但是仍碰到很多用户在实验中存在着由于不当操作而数据精度不高、重复性差、可信度差等问题。在这里，我们根据实际工作中的经验以及参考万谦等人^[1]的研究，给大家详细说明一些有助于提高实验质量的操作技巧，希望能给大家带来一定的帮助。

1、引物的操作技巧：

使用引物设计软件进行设计时，在操作界面上设定相应的参数，扩增子参数一般设定范围为80 ～ 200bp，扩增子长度越短，扩增效率越高，可选择设定在110bp，110bp在后期的扩增中仅用10s，其余的参数均默认，软件即给出引物列表，一般选用评分高或者靠前的，因为评分越高或越靠前的引物对形成引物二聚体的可能越小。

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引物一般由试剂公司合成，为干粉状态，在溶解前，最好用高速离心机低温快速离心30s，使得引物干粉汇聚到管底，避免损失引物。引物收到后，需要先摸索引物的退火温度和终浓度，以达到较理想的qPCR扩增效果，其次测定引物的扩增效率，通常在非正式实验时，假定引物的扩增效率为100%，扩增产物在指数期呈现2n的增长。在正式实验时，考虑到引物的扩增效率实际不是100%，所以需要测定引物的扩增效率以修正结果。一个测定引物扩增效率的简单方法如下: 以cDNA样品或标准品为模板，依次稀释 10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶ 倍，采用前期摸索好的qPCR扩增条件，得到6个Cq值，然后以log（模板浓度）为X轴变量，以Cq值为Y轴变量作回归直线图，得到直线的斜率，扩增效率 = 10( ^{－1 /斜率}) － 1，整个数据计算可以在Excel中完成，也可在qPCR软件中直接得出。

2、反应体系配制技巧：

正式实验时，每个样本至少3个重复，为了消除各重复之间的系统误差，可配置3.2个反应体系，将所需的所有试剂和模板加在同一个PCR管中，充分涡旋混匀后，再分装到3个重复孔中，这样可有效减小系统误差。另外，一些实验者为了节省试剂，采用10μL反应体系，我们认为这是不可取的，因为体积太小，加样误差会大，这样做得不偿失，建议使用20μL以上的反应体积。如上操作，可以在较大程度上消除由于加样不准造成的系统误差。

如表1所列，“优化前”是5管中分别依次加入模板和各反应试剂，最后得到的Cq值标准偏差为2.66；“优化后”是使用模板和各反应试剂的混合液，然后分装至5管中，最后得到的Cq值标准偏差为0. 32；由上述可见，数据精度得到极大的改善。

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Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司，配备高品质温度模块，采用光纤和CMOS的检测系统，高能LED的激发，提供高灵敏和可靠的数据。

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参考文献：

[1]万谦, 陆华. 实时荧光定量PCR的一些操作技巧[J]. 实验科学与技术, 2012(S2):189-190.