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基于cielo和naica系统,多重PCR荧光染料该怎么选呢

什么是多重PCR?

多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction,mPCR)也称复合PCR,它是在同一PCR反应体系中加入一对以上引物,各对引物分别结合在模板相对应位置,最终扩增出一条以上目的DNA片段(图1),其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

▲ 图1:多重PCR反应示意图(图源网络,侵删)

荧光定量PCR可以实现多重PCR吗?

当然是可以的,荧光定量PCR除了常规的单基因定量外,也是可以实现多个基因的同时检测。单基因检测我们一般使用染料法,通过染料分子与双链DNA的结合来进行PCR反应的实时监测,但是这种结合是非特异的,我们无法区分同一个PCR反应体系中的多个目的DNA片段,因此需要采用另一种方式来同时进行多基因的检测,也就是探针法。

▲ 图2:染料法和探针法的检测原理(图源网络,侵删)

探针法通过与模板特异性结合的探针解决了特异性的问题,同时不同的探针可以标记不同的荧光基团,通过对不同探针之间的识别,从而实现对多个基因的同时检测和定量。但是这又带来一个问题,就是在针对不同基因设计探针时该如何选择荧光基团呢?

在选择荧光基团时首先要考虑一个问题,您要使用的仪器所配置的荧光通道是怎样的,这里就以Azure Cielo™ 6实时荧光定量PCR系统和Stilla naica® 6色微滴芯片式数字PCR系统为例来进行说明。

▲ 图:多重检测示意图(图源网络,侵删)

Azure Cielo™ 6实时荧光定量PCR系统共有6个荧光通道,最多可同时检测6个基因。为什么能同时检测这么多基因呢,这里就要科普一个小知识了,那就是荧光是怎么产生的。当激发光照射到荧光基团上时,荧光基团就会发出发射光,也就是我们需要的荧光信号,对于不同的荧光基团,其接收的激发光和发射的发射光波长都是不一样的,因此需要根据机器的特性进行选择。对于Azure Cielo™ 6实时荧光定量PCR系统,只要使用的荧光基团在6个通道的激发和发射波长的范围内,都支持使用。其次,Azure Cielo™ 6实时荧光定量PCR系统的荧光检测通道的设计之初,就是要覆盖市面上大多数的荧光基团类型,所以基本不需要担心探针适配性问题。

▲ 图4:Azure Cielo™ 6实时荧光定量PCR系统的荧光检测通道

naica® 6色微滴芯片式数字PCR系统荧光探针的选择与Azure Cielo™ 6相似,对于naica® 6色微滴芯片式数字PCR系统而言,其同样配置有6个荧光检测通道,6个通道的波长范围也基本覆盖了市面上大部分的荧光基团,无需担心适配性和选择问题。

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naica®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统,源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术,自动化微滴生成和扩增,每个样本孔可实现6荧光通道的检测,智能化识别微滴并进行质控,3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。