免疫荧光显微成像详解（下）——免疫荧光常见问题分析

前言

上期我们进行了免疫荧光原理、实验步骤的探讨，本期我们一起走进免疫荧光常见问题的分析，帮助大家解决在实验过程中遇到的一些问题，让大家都能成为免疫荧光小能手。

常见问题

1背景荧光高

① 洗涤不足——充分洗涤，适当增加洗涤次数和时间；

② 样本干燥——在湿盒中孵育抗体，避免干燥；

③ 抗体浓度过高——预实验测定最佳浓度；

④ 样本自发荧光——染色前先行检测自发荧光情况；

⑤ 封闭不充分——延长封闭时间或更换封闭液；

⑥ 二抗非特异性结合——做一组只加二抗孵育的作为对照；

⑦ 抗体孵育时间过长——严格控制孵育时间，适当减少孵育时间；

⑧ 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)——有时切片脱蜡至修复会过夜，第二天加抗体进行染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长；

⑨ 荧光背景噪音大——更换荧光显微镜，使用能够降低背景荧光干扰的显微镜。

2荧光信号弱

① 荧光通道的激发波长和发射波长与染料不匹配——确保使用的显微镜的荧光通道与染料荧光基团的波长相匹配；

② 一抗或二抗不兼容——注意种属是否正确；

③ 一抗不好用——阳性对照确认抗体有效性；

④ 固定过度或不充分——适当调整固定时间；

⑤ 样本保存不当导致荧光淬灭——注意保存过程中的湿度和避光；

⑥ 一抗变质或质量差的多克隆抗体——注意抗体有效期，与新买抗体或用过的抗体作比较；

⑦ 信号弱或无信号——可裂解细胞后，用WB验证目标蛋白在细胞中是否表达；

⑧ 显微镜收集荧光和成像的能力差——选择一款相机配置好、荧光收集能力强、成像效果好的荧光显微镜。

3细胞/组织形态被破坏

① 组织从玻片上脱落或有气泡——适当增加固定时间，封片时注意不要产生气泡；

② 细胞或组织固定不充分，自发裂解——使用交联性固定剂，适当增加固定时间；

③ 组织切片撕裂或有褶皱——切片过程导致的问题，考虑重新进行切片。

4定位不对

可使用带明场通道的荧光显微镜进行共定位，如下图：

① 细胞核干扰——细胞核位置前面的细胞质染色干扰造成，可以降低抗体浓度或孵育时间；

② 细胞或者组织状态不对——细胞或者组织状态不同导致目的蛋白细胞定位不同，造成最后的定位不对，可重新培养细胞调整好状态或者重新取材，进行再次染色；

③ 核定位不对——可将封闭和打孔合为一步，即在封闭液中添加0.5% TRITON-100，37℃封闭2h，加一抗后最好4℃孵育过夜(16h)；

④ 不确定观察到的是不是需要的染色位置——使用带明场通道的荧光显微镜，进行荧光定位，确定观察到的染色位置是否正确。

对照实验设置

1内源性组织背景对照

某些含有固有的生物化学性质的组织或细胞，会产生背景或自发荧光，对结果产生影响。以下图为例，DAPI染核，FITC染边界和中间的晶状结构，而TRITC染整个组织背景的颜色，但绿色也产生了背景荧光，对三通道叠加造成了干扰。

2阴性对照

使用确定不含有待测抗原的细胞或组织，与待测样本统一处理，同一观察，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性。

3阳性对照

与阴性对照相反，用确定含有待测抗原的细胞或组织，与待测样本统一处理，同一观察，结果若为阳性，可证明待测抗原具有活性且实验过程没有问题，方法操作可靠。

免疫荧光高清成像

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